مجله تازه های بیوتکنولوژی سلولی مولکولی دوره ششم شماره بیست و دو بهار 1395 بررسی اثر محرک های شیمیایی متیل جاسمونات و سالیسیلیک اسید بر تحریک تولید هایپرسین در گیاه گل راعی ( )perforatum Hypericum امیر رجبی* 1 حسین عباسپور 1 جعفر مسعود سینکی 2 2 باشگاه پژوهشگران جوان و نخبگان دانشگاه آزاد اسالمی واحد دامغان دامغان ایران چکیده زمینه و هدف : در این پژوهش اثر محرک های شیمیایی متیل جاسمونات و سالیسیلیک اسید در محیط کشت پایه ( )MS بر تحریک تولید هایپرسین در یک دوره 42 روزه مورد بررسی قرار گرفت. مواد و روش ها : ریز نمونه های برگ و ساقه به محیط MS حاوی محرک های متیل جاسمونات و محرک سالیسیلیک اسید منتقل شدند. عصاره های متانولی این گیاه به وسیله دستگاه HPLC به منظور بررسی تغییرات در میزان هایپرسین مورد تحلیل قرار گرفتند. یافته ها : نتایج نشان دادند که غلظت 100 میکروموالر متیل جاسمونات نسبت به سایر غلظت ها بیش ترین میزان هایپرسین ( )%34/66 را تولید می کند. هم چنین نیز استفاده از غلظت های بیشتر از 100 میکروموالر سالیسیلیک اسید باعث از بین رفتن نمونه های کشت بافتی گیاه گل راعی می شود. نتیجه گیری : محرک شیمیایی متیل جاسمونات در افزایش میزان هایپرسین در کشت بافت گل راعی بسیار تاثیر داشته است. اما محرک شیمیایی سالیسیلیک اسید تاثیر محسوسی در افزایش میزان هایپرسین در گیاه گل راعی نداشت. کلمات کلیدی : هایپرسین متیل جاسمونات سالیسیلیک اسید گل راعی متابولیت های ثانویه مقدمه گل راعی با نام علمی Hypericum perforatum از خانواده Hypericaceae از گیاهان دارویی بسیار مهم است )1(. گياهي است علفي و چند ساله كه بومي اروپا و آسيا مي باشد. استفاده سنتي از اين گياه به بيش از 2000 سال پيش بر مي گردد. در منابع فارسی به گل راعی علف چای هوفاریقون و گل هزار چشم نیز گفته می شود )39(. اجزای موثر بیولوژیکی مختلفی در این گیاه مانند هایپرسین وجود دارد )25(. جنس Hypericum بيش از 469 گونه در جهان دارد كه 17 گونه آن تا كنون از ايران گزارش شده است. گونه های مختلف این گیاه در بسیاری از کشور ها به عنوان عامل شفادهنده به کار می رود و دارای خواص مختلف پزشکی است. ( )17 گل راعی به طور سنتی و مدرن برای درمان عارضه های عصبی و افسردگی استفاده می شود )11(. هم چنین این گیاه دارای اثرهای فارماکولوژیکی متعددی از جمله اثرهای ضد درد ضد التهاب ضد تومور آنتی اکسیدان ضد باکتریایی ضد میکروبی و ضد سرطانی می باشد )7(. ترکیب های موثر اصلی این گیاه شامل هایپرفورین (یک فلوروگلوسینول پرنیله شده) و هایپرسین (یک نفتودیانترون) می باشد. البته ترکیب های موثر بیولوژیکی دیگری نظیر فالونویید و تانن نیز در این گیاه وجود دارد )15(. در دهه 1960 جاسمونات به عنوان گیاهان دارویی از ارزش و اهمیت خاصی در تامین بهداشت و سالمت جوامع هم به لحاظ درمان و هم پیش گیری از بیماری ها برخوردار بوده و هستند. این بخش از منابع طبیعی قدمتی هم پای بشر داشته و یکی از مهم ترین منابع تامین غذا و داروی بشر در طول نسل ها بوده اند )23(. یکی از راه کارهای تولید متابولیت های ثانویه در گیاهان دارویی کشت آنها در شرایط کنترل شده آزمایشگاهی می باشد. کشت بافت روشی مناسب جهت تکثیر آسان برای تولید گیاهان یکسان از نظر ژنتیکی و افزایش میزان ماده موثره می باشد )12(. در شرایط آزمایشگاهی می توان متابولیت های با ارزش مورد نظر را در تمام فصول سال و با مقدار و کیفیت دلخواه تولید کرد )19(. ـــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــ *آدرس نویسنده مسئول : گروه کشاورزی دانشگاه آزاد واحد دامغان پست الکترونیکی Amir.rajabi1368@gmail.com : تاریخ دریافت 1394/01/16 : تاریخ پذیرش 1394/04/06 : 41 1 گروه کشاورزی دانشگاه آزاد اسالمی واحد دامغان دامغان ایران
تازه های بیوتکنولوژی سلولی - مولکولی دوره ششم شماره بیست و دو - بهار 1395 بررسی اثر محرک های... متابولیت های ثانویه در اسانس گیاه گل یاس مشاهده شد. دو دهه پس از شناسایی اولیه جاسمونات ها تاثیر فیزیولوژیکی آنها شناسایی و به عنوان ترکیبات پیش برنده ی پیری بازدارنده رشد و محرک هایی برای متابولیت ثانویه در گیاهان عالی شناخته شدند (.)30 جاسمونیک اسید و متیل استر آن (متیل جاسمونات) ترکیب های مشتق شده از سیکلوپنتان لینولنیک اسید می باشند جاسمونات ها از مسیر اکتادکانوئید ساخته می شوند که در این مسیر لینولنیک اسید به جاسمونیک اسید تبدیل می شود )27(. سالیسیلیک اسید ( 2 هیدروکسی بنزونیک اسید) یک ترکیب فنلی طبیعی و از تنظیم کنند ه های رشد است كه نقش هاي كليدي در رشد و نمو گياه و پاسخ به تنش هاي محيطي ايفا می كنند. نام سالیسیلیک اسید از کلمه سالیکس نام علمی درخت بید گرفته شده است )13(. سالیسیلیک اسید از نظر شیمیایی متعلق به گروه بسیار متنوع فنل هاي گیاهی می باشد که داراي یک حلقه آروماتیک به همراه یک گروه هیدروکسیل با مشتقات وابسته به آن می باشد )34(. یکی از دادند. محرک اسید سالیسیلیک نیز باعث تغییر محتوای شیمیایی و افزایش درصد ترکیبات گردید و هم چنین رفتار اسید سالیسیلیک باعث تولید درصد باالتری از آلکان ها و اسید های چرب نیز شد (.)21 غده های سیاه دارای هایپرسین و سودو هایپرسین در امتداد حاشیه برگ ها قرار می گیرند. غده های سیاه مشابه را بر روی برگ های جدید نهال های طبیعی مشاهده گردید و هایپرسین و سودو هایپرسین در عصاره های این نهال ها از طریق تحلیل HPLC آنالیز گردید (.)32 با توجه به بررسی منابع تاکنون مطالعه ای در خصوص اثر محرک های شیمیایی متیل جاسمونات و سالیسیلیک اسید بر روی ترکیب ثانویه هایپرسین در گیاه گل راعی تحت شرایط کشت بافت انجام نشده است. کاربرد محرک ها تنظیم کننده ها و بازدارنده های رشد در گیاهان دارویی عالوه بر رشد نیز ممکن است باعث تحریک تولید متابولیت ثانویه شود. بنابراین هدف این مطالعه بررسی سطوح غلظت های مختلف محرک های شیمیایی متیل جاسمونات و سالیسیلیک اسید بر تحریک تولید هایپرسین و هم چنین شناسایی بهترین غلظت محرک های شیمیایی متیل جاسمونات و سالیسیلیک اسید از نظر دارا بودن درصد باالی میزان هایپرسین در گیاه گل راعی می باشد. آنالوگ هاي این ترکیب استیل سالیسیلیک اسید (آسپرین) است که پس از جذب به سرعت به سالیسیلیک اسید تبدیل می شود. ( )14 يكي از مهم ترين انواع گياهان دارويي گل راعی مي باشد و مهم ترين ويژگي اين گياه دارا بودن هايپرسين به عنوان مهم ترين ماده مؤثره در برگ و گل هاي آن مي باشد كه نقش بسيار مهمي در درمان انواع بيماري ها دارد )3(. موارد مصرف و خواص دارویی آن نیز به خوبی مطالعه شده است اما مطالعه های کشت بافت و تحریک تولید هایپرسین به کمک محرک های شیمیایی متیل جاسمونات و سالیسیلیک اسید انجام نشده است. بهترین و سری ع ترین راه برای داشتن گیاه جهت مصارف صنعتی کشت بافت است. هم چنین با در نظر گرفتن اهمیت و خواص دارویی این گیاه مطالعات کشت بافت و بهین ه سازی محیط کشت جهت اهداف مختلف برای این گیاه ضرورت دارد. فرضیه پژوهش این بود که محرک های شیمیایی متیل جاسمونات و سالیسیلیک اسید تحت شرایط کشت بافت تولید هایپرسین را تحریک می کنند یا نمی کنند. مقدار کلی هایپرسین می تواند از طریق تحریک زیستی و غیر زیستی افزایش یابد و این ممکن است منجر به اثبات آن شود که این متابولیت ها قسمتی از سیستم تدافعی گونه های Hypericum هستند. جاسمونات ها به عنوان ترکیب های پیام رسان کلیدی در فرایند القاء که منجر به تجمع متابولیت های ثانویه می شود معرفی شده اند )16(. مقدار کل هایپرسین در کشت های سوسپانسیون سلولی رشد یافته تحت شرایط نوری 2/4 برابر کم تر از کشت های سوسپانسیون سلولی رشد یافته تحت شرایط تاریکی است. مشاهده گردید که تزریق m µ 250 جاسمونیک اسید باعث افزایش تجمع هایپرسین در سلول های رشد یافته تاریکی در مقایسه با کشت های رشد یافته تحت شرایط مواد و روش ها تهیه ضدعفونی و کشت بذور این پژوهش در آزمایشگاه کشت بافت دانشکده کشاورزی دانشگاه آزاد اسالمی واحد دامغان انجام شد. جهت انجام تحقیق حاضر بذور گل راعی در سال زراعی 93 92 از شرکت پاکان بذر اصفهان تهیه گردید. بذرها پس از تهیه به آزمایشگاه کشت بافت دانشگاه انتقال داده و در کیسه های کاغذی در دمای اتاق ( 20 25 C در تاریکی 42 نوری و کنترل های مربوط می شود اگر چه تزریق 250 m µ جاسمونیک اسید باعث افزایش رشد و تولید هایپرسین در کشت های سوسپانسیون سلولی گل راعی می شود اما غلظت های دیگر جاسمونیک اسید تحت شرایط نور و تاریکی همان تاثیر را دارند. ( )13 در کشت سوسپانسیون سلول گونه Pueraria tuberosa ( )8 تیمار 400 میکرومول متیل جاسمونات در مقایسه با سایر تیمارها ( 200 100 50 و 400 میکرومول) و شاهد بیش ترین تاثیر را در تولید ایزوفالونوئید ها داشته است. هم چنین در همین غلظت نیز سالیسلیک اسید تأثیر مشابه با متیل جاسمونات داشته است )26(. تيمار گياه همیشه بهار با 50 ميكرومول متيل جاسمونات سبب سنتز سسكويي ترپن α Muureloene توسط گياه و بروز آن در اسانس گردید. ميزان اين ماده در تيمار با 100 ميكرومول متيل جاسمونات به دو برابر افزايش يافت )37(. در مطالعه ا ی اثر محرک اسید سالیسیلیک و استخراج تولید متابولیت ثانویه از کشت سلولی گیاه جاتروفا )4( Jatropha curcas L را مورد بررسی قرار
تازه های بیوتکنولوژی سلولی - مولکولی دوره ششم شماره بیست و دو امیر رجبی و همکاران به دستگاه آون با دمای 40 درجه ساتی گراد انتقال داده شد. عصاره تغلیظ شده به دست آمده تا زمان آزمایش در جای خشک خنک و دور از نور قرار داده شد. عصاره گیاه مورد نظر پس از استخراج به دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارایی باال ( )HPLC تزریق گردیدند. اندازه گیری هایپرسین با روش کروماتوگرافی مایع با کارایی باال ( )HPLC اندازه گیری هایپرسین توسط دستگاه HPLC مدل KNAUER ساخت کشور آلمان شامل پمپ 1001 K دتکتور ( UV برای هایپرسین 240 نانومتر) ستون 18 C نرم افزار EZChrom Elite انجام شد. فاز متحرک دستگاه شامل 2 قسمت A و B می باشد. فاز متحرک A شامل بافر آمونیوم استات که تشکیل شده از 771 mg آمونیوم استات جامد در 1000 ml آب که ph آن با استیک اسید روی 5 تنظیم شده است. فاز متحرک B نیز از 900 ml استونیتریل و 100 ml متانول تشکیل شده است 20. میکرولیتر از نمونه های استخراج شده به دستگاه تزریق شدند و با سرعت جریان یک میلی لیتر در دقیقه از ستون 18 C به قطر ذرات 5 mµ و ابعاد 250 4/6 mm عبور کردند. هر نمونه در طول موج 240 نانومتر برای هایپرسین طی زمان 25 20 دقیقه اندازه گیری و شناسایی شد. طیف های مربوط به هایپرسین با استاندارد مقایسه و مقادیر هر یک براساس طیف استاندارد محاسبه شد )24(. تهیه محلول استاندارد هایپرسین برای به دست آوردن پیک استاندارد هایپرسین ابتدا استاندارد هایپرسین که یک ماده ای پودری به میزان 1 میلی گرم بود در cc10 متانول حل شد و سپس 20 میکرولیتر از نمونه استاندارد به دستگاه تزریق شدند. محاسبه درصد هایپرسین در کروماتوگرام HPLC به صورت زیر می باشد : 200 150 100 50 و 400 میکرو موالر) مورد ارزیابی قرار گرفتند. استقرار در محیط کشت حاوی محرک های متیل جاسمونات و سالسیلیک اسید به دلیل این که محرک متیل جاسمونات به صورت مایع روغنی است ابتدا استوک از محرک متیل جاسمونات تهیه شد 0/15. گرم محرک متیل جاسمونات وزن شد و در میکروتیوب ها ی حاوی cc 5 اتانول ریخته و تکان داده شد تا به طور کامل حل شود و به کمک سمپلر میزان غلظت های مورد نیاز بر داشته شد. در حالی که محرک سالیسیلیک ماده ای پودری بود ابتدا آن به اندازه میزان غلظت های مورد نیاز وزن شده و در میکروتیوب با چند قطره اتانول حل شد. سپس در زیر هود المینار پس از فیلتر استریل شدن (فیلتر 0/2 میکرومتر) به محیط کشت اضافه گردیدند و در ادامه محیط کشت MS حاوی غلظت های مختلف محرک های متیل جاسمونات و سالیسیلیک اسید را به درون ویال ها منتقل شد. هم چنین نیز تیمارهای فوق در سه تکرار و در هر تکرار با 8 ریز نمونه انجام شدند. سپس نیز ریز نمونه های رشد یافته پس از 60 روز به منظور تحریک هایپریسین از محیط کشت پایه در شرایط آزمایشگاهی از قسمت های مختلف گیاه (ساقه و انتهای باالی چهار یا شش برگی) بریده شده و به محیط کشت حاوی غلظت های مختلف محرک های متیل جاسمونات و سالیسیلیک اسید انتقال یافتند. تهیه عصاره متانولی برای تهیه عصاره متانولی ابتدا 2 گرم نمونه داخل هاون چینی ریخته و 20 cc متانول به آن اضافه و ساییده شدند سپس محلول های حاصل سانتریفوژ شدند. فاز تشکیل شده باال برداشته و جهت تغلیظ یافته ها در این قسمت طیف های مربوط به کروماتوگرام استاندارد هایپرسین نمونه شاهد و نمونه های تحت تیمار محرک های شیمیایی متیل جاسمونات و سالسیلیک اسید در گیاه گل راعی مورد بررسی قرار گرفتند. جدول درصد هایپرسین (جدول )1 و کروماتوگرام طیف نمونه استاندارد هایپرسین در دقیقه 05:38 نیز طیف مربوط به هایپرسین را نشان می دهد (شکل.)1 بنابراین میزان درصد هایپرسین در نمونه شاهد در زمان 06:02 برابر با %1 می باشد (شکل.)2 کروماتوگرام طیف نمونه متانول که بدون متابولیت ثانویه هایپرسین می باشد را نشان می دهد (شکل.)3 کروماتوگرام های طیف تیمار مختلف محرک شیمیایی متیل 43 ) تا زمان استفاده نگه داری شدند. ابتدا بذر ها به مدت 10 دقیقه با آب روان شست و شو داده سپس همراه با یک قطره مایع ظرف شویی در 70 cc آب مقطر به مدت 5 دقیقه شیک شدند و دوباره با آب مقطر به مدت 1 دقیقه شست و شو داده شد و یک بار نیز بذرها با هیپوکلرید سدیم (وایتکس ) %1 به مدت 7 دقیقه در زیر محفظه دستگاه هود المینار نیز شیک شدند و دوباره با آب مقطر استریل شده 3 مرتبه با بازه های زمانی 10 5 و 7 دقیقه در زیر محفظه دستگاه هود المینار شست و شو داده شد )5(. سپس بذر ها بر روی محیط کشت MS حاوی 30 گرم ساکاروز و 7/5 گرم آگار با 5/7 ph تا 5/8 قرار داده شد و در اتاقک رشد با شرایط نوری 2400 لوکس دوره نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی در دمای 3 21 ± سانتی گراد نگه داری شدند. به منظور بررسی اثر محرك های شیمیایی متیل جاسمونات و سالیسیلیک اسید بر میزان هایپرسین غلظت های مختلف محرک متیل جاسمونات (شاهد 100 50 250 150 و 500 میکرو موالر) و محرک سالیسیلیک اسید (شاهد
تازه های بیوتکنولوژی سلولی - مولکولی دوره ششم شماره بیست و دو - بهار 1395 بررسی اثر محرک های... جاسمونات نتایج جدول درصد میزان هایپرسین (جدول )2 و کروماتوگرام طیف هایپرسین در تیمار 50 میکروموالر در دقیقه 06:31 کم ترین میزان درصد هایپرسین ( )%19/21 را نسبت به سایر غلظت ها نشان می دهد (شکل.)4 هم چنین کروماتوگرام طیف هایپرسین و جدول درصد هایپرسین در تیمار 100 میکروموالر در زمان 07:11 مشاهده شد (جدول )3 که بیشترین میزان هایپرسین را در این تیمار ایجاد نمود که برابر با ( )%34/66 می باشد (شکل )5 و در تیمار 150 میکروموالر در زمان 06:09 میزان هایپرسین برابر با ( )%33/37 بود (جدول ( )4 شکل.)6 کروماتوگرام طیف های هایپرسین و جدول درصد میزان هایپرسین در تیمارهای 250 و 500 میکرو موالر (جدول 5 و جدول )6 میزان درصد هایپرسین را در زمان 06:06 دقیقه به ترتیب با میزان های ( %27/10 و )%30/97 نشان می دهد (شکل 7 و.)8 جدول.2 درصد هایپرسین در تیمار 50 میکروموالر متیل جاسمونات جدول.3 درصد هایپرسین در تیمار 100 میکروموالر متیل جاسمونات جدول.1 درصد هایپرسین در نمونه استاندارد هایپرسین شکل.5 کروماتوگرام طیف هایپرسین در تیمار 100 µm متیل جاسمونات شکل.1 کروماتوگرام طیف نمونه استاندارد هایپرسین جدول.4 درصد هایپرسین در تیمار 150 میکروموالر متیل جاسمونات شکل.2 کروماتوگرام طیف هایپرسین در نمونه شاهد شکل.3 کروماتوگرام طیف نمونه متانول شکل.6 کروماتوگرام طیف هایپرسین در تیمار 150 µm متیل جاسمونات 44 شکل.4 کروماتوگرام طیف هایپرسین در تیمار 50 µm متیل جاسمونات
تازه های بیوتکنولوژی سلولی - مولکولی دوره ششم شماره بیست و دو امیر رجبی و همکاران جدول.5 درصد هایپرسین در تیمار 250 میکروموالر متیل جاسمونات جدول.6 درصد هایپرسین در تیمار 500 میکروموالر متیل جاسمونات جدول.8 درصد هایپرسین در تیمار 100 میکروموالر سالیسیلیک اسید کروماتوگرام های طیف تیمار مختلف محرک شیمیایی سالیسیلیکاسید کروماتوگرام طیف هایپرسین در تیمار 50 میکروموالر در زمان 07:56 دقیقه مشاهده شد که میزان هایپرسین در این تیمار برابر با ( )%11/46 می باشد (شکل ( )9 جدول )7 و در تیمار 100 میکروموالر در زمان 07:08 میزان هایپرسین برابر با ( )%4/11 می باشد (شکل ( )10 جدول.)8 در نتیجه نیز در بقیه غلظت ها ریز نمونه ها از بین رفتند (ریز نمونه ها خشک شده بودند). شکل.10 کروماتوگرام طیف هایپرسین در تیمار 100 µm سالیسیلیک اسید بحث در این مطالعه نتایج اثر غلظت های مختلف محرک های شیمیایی متیل جاسمونات و سالیسیلیک اسید بر تحریک تولید هایپرسین نشان دادند که محرک شیمیایی متیل جاسمونات در افزایش میزان هایپرسین در کشت بافت گل راعی بسیار تاثیر داشته است. شرایط نور و روش های تنظیم کننده رشد بر رشد کشت های سلولی H.perforatum در محیط کشت پایه تاثیر می گذارند که با نتایج ما مطابقت داشت )33(. در کشت سوسپانسیون سلولی گل راعی غلظت 250 میکرو موالر جاسمونیک اسید نسبت به سایر غلظت ها ( 100 50 میکرو موالر) میزان هایپرسین بیش تری تولید می کند ( 26 میکرو گرم بر گرم وزن خشک) )23(. مطالعه های انجام شده نشان داده است که به طور معمول از متيل جاسمونات خارجي در كشت سلولي گياهي براي فعال كردن متابوليسم ثانويه استفاده مي شود اما مطالعه هایی كه در مورد تأثير آن بر رشد گياه گل راعی صورت گرفته است نشان مي دهد كه جاسمونات ها فعاليت هاي زيستي گوناگوني مانند بازدارندگي رويش و جوانه زني دانه و دانه گرده و مهار رشد ريشه و دستگاه هاي فتوسنتزي دارند )35(. مطالعه های انجام شده بر روی اثر متیل جاسمونات بر روي ترکیب های ثانویه ریحان شیرین نشان داده است که افزایش متیل جاسمونات از 0/1 به 0/5 میلی موالر سبب افزایش میزان فنل تام در ریحان شده است. جدول.7 درصد هایپرسین در تیمار 50 میکروموالر سالیسیلیک اسید شکل.8 کروماتوگرام طیف هایپرسین در تیمار 500 µm متیل جاسمونات 45 شکل.7 کروماتوگرام طیف هایپرسین در تیمار 250 µm متیل جاسمونات شکل.9 کروماتوگرام طیف هایپرسین در تیمار 50 µm سالیسیلیک اسید
تازه های بیوتکنولوژی سلولی - مولکولی دوره ششم شماره بیست و دو - بهار 1395 بررسی اثر محرک های... ( )28 گزارش شده است که اسید جاسمونیک و متیل جاسمونات بر میزان ترکیبات و مواد موثره آویشن دنایی تاثیرگذار بوده به طوري که غلظت هاي مختلف به کار رفته نوع و مقدار ترکیبات ثانویه اسانس را کاهش یا افزایش دادند )10(. آنتوسيانين ها و فنل ها متابولیت هاي ثانويه گياهي است كه از گياه در برابر واكنش هاي فتوديناميك آسيب رساننده با سركوب كرد ن گونه هاي فعال اكسيژن حفاظت مي كنند. مطالعه های انجام شده مشخص كرده است كه كاربرد تركيب هایي كه به طور طبيعي يافت مي شوند مانند متيل جاسمونات مي تواند باعث افزايش متابوليت هاي ثانويه شود. براي مثال تيمار گياهان توت سياه با متيل جاسمونات محتواي فال ونوييد رابه طور معني دار در اين گياهان افزايش داد. ( )36 اثرهای دو محرک جاسمونیک اسید و متیل جاسمونات بر رشد سلول و هم چنین در تجمع اسید رزمارینیک در کشت سوسپانسیون سلولی از پونه و نعناع را مورد بررسی قرار گرفت. باالترین تجمع اسید رزمارینیک 117/95 میلی گرم بر گرم ( )%12 DW 1 DW بود. نتیجه گیری عالوه بر این نیز پس از 24 ساعت 100 میکرو لیتر متیل جاسمونات اندازه گیری شد که مشابه غلظت 110/12 میلی گرم بر گرم پس از 48 ساعت استفاده از 200 میکرو لیتر اسید جاسمونیک می باشد. ارزش آن بدون استخراج نزدیک به 1/5 برابر بیش تر نسبت به نمونه شاهد شد. تاثیر محرک ها بر ترشح اسید رزمارینیک در کشت قابل توجهی وجود - دارد. کشت سوسپانسیون سلولی نعناع تحت تاثیر با محرک - ها نشان داد که کاهش در تجمع زیست توده داشته است. ( )31 در پژوهشی واكنش گياهي مينا چمني Bellis perennis )9(.L از تيره كمپوزيته در پاسخ به تيمار ساليسيليك اسيد و ميزان تجمع دو متابوليت ثانويه ساپونين و آنتوسيانين به ترتيب در ريشه ها و برگ هاي گياه مورد بررسي قرار گرفت. نتايج حاكي از آن است كه مقدار تركيب هاي ثانويه ساپونين و آنتوسيانين در گياهان تيمارشده با غلظت هاي 7 3 و - 11 ميكروموالر ساليسيليك اسيد نسبت به گياهان تيمار نشده با ساليسيليك اسيد و بدون آلودگي (گياهان كنترل) افزايش پيدا مي كند (.)6 ساليسيليك اسيد فعاليت آنزيمر هاي كاتاالز و آسكوربات پراكسيداز را در برگ ها و كشت هاي سوسپانسيون مریم گلی ممانعت مي كند و از اين طريق در شرايط اين ويترو و اين ويو ممانعت مي شود بنابراين پيشنهاد شده كه مكانيسم عمل ساليسيليك اسيد به طور احتمال افزايش مقدار ROS از طریق توقف توانايي كاتاالز براي تجزيه H2O2 می باشد (.)18 ساليسيليك اسيد تحت تنش كادميوم باعث افزايش محتواي كلروفيل و بيوسنتز آن در گياه )2( Arabidopsis thaliana مي گردد ( )38 محرک سالیسیلیک اسید وقتي به طور خارجي به كار برده شوند نيز با روشي معين در طول گياه حركت مي كنند و باعث بيان شدن ژن هاي دفاعي خاصي در گياه مي شوند )22(. برگ - های محرک شیمیایی متیل جاسمونات در افزایش میزان هایپرسین در کشت بافت گل راعی بسیار تاثیر داشته است. اما محرک شیمیایی سالیسیلیک اسید تاثیر محسوسی در افزایش میزان هایپرسین در گیاه گل راعی نداشت. از بین غلظت های محرک شیمیایی متیل جاسمونات مورد استفاده غلظت 100 میکروموالر متیل جاسمونات بیش ترین میزان هایپرسین ( )% 34/66 را تولید کرد و در غلظت 50 میکروموالر متیل جاسمونات کم ترین میزان هایپرسین مشاهده شده است. در غلظت 50 میکروموالر سالیسیلیک اسید میزان هایپرسین چند برابر شاهد شده است و در غلظت 100 میکروموالر سالیسیلیک اسید نیز میزان درصد هایپرسین به طور تقریب دو برابر شاهد است. هم چنین تنها در غلظت های شاهد 50 و 100 میکروموالر محرک شیمیایی سالیسیلک اسید ریزنمونه ها سالم بوده و در بقیه غلظت ها نیز نمونه های کشت بافت زرد و خشک شدند در نتیجه از بین رفتند. در این تحقیق سعی شد تا با کاربرد غلظت های مختلف محرک های شیمیایی متیل جاسمونات و سالیسیلیک اسید بهترین غلظت جهت به دست آوردن بیش ترین میزان هایپرسین برای کاربرد در محیط کشت بافت پیدا شود. تا با کاربرد اثر سایر القا کننده ها بتوان به مقدار بیش تری از ترکیبات ثانویه مفید دست یافت. کشور ایران از منابع مهم گیاه گل راعی به شمار می رود و با انجام تحقیق های بیش تر باید سعی در افزایش تولید و فرآوری این گیاه ارزشمند شود. لذا برای شناخت بهره برداری و فرآوری این گیاه دارویی مهم و ایجاد اشتغال برای تحقیق های بیش تر پیشنهاد می شود که از سایر محرک های رشد بر روی گیاه گل راعی جهت افزایش تولید متابولیت های ثانویه استفاده شود و هم چنین تحقیق 46 H.perforatum اصل و منبع استخراج هایپرسین بوده است. مقدار باالتری از هایپرسین را که در کشت های سلولی رشد یافته در شرایط تاریکی نسبت به برگ هایی مشاهده شد که یک ماه زودتر در محیط پایه کشت داده بودند )20(. با تحقیق هایی که برای بررسی میزان هایپرسین انجام گردید بیش ترین و کم ترین میزان هایپرسین %6 و %4 به ترتیب در برگ ها و گل ها به دست آمده است. هم چنین کاهش مدت زمان سایه به علت افزایش دسترسی به نور خورشید در دو مناطق رویشگاه های طبیعی گل راعی باعث فراهم شدن حرارت بیش تر در طول روز شده که در افزایش میزان هایپرسین نیز موثر می باشد )39(. محرک منان تولید هایپرسین و سودو هایپرسین را با مقدار 0/05 0/1 mg/ml در اندام شاخه ای کشت ها تحریک می کند و محرک منان باعث افزایش تولید متابولیت های ثانویه در کشت بافت گل راعی می شود. هم چنین نیز عوامل محرک زیستی و غیر زیستی می تواند باعث تنظیم رو به باالی بیوسنتز متابولیت های ثانویه در گیاهان سالم و کشت های سلولی شوند )29(.
تازه های بیوتکنولوژی سلولی - مولکولی دوره ششم شماره بیست و دو امیر رجبی و همکاران های دیگری جهت شناسایی ترکیب های شیمیایی گونه های دیگر جنس Hypericum انجام شود. سپاسگزاري از مسؤلين محترم دانشکده کشاورزی دانشگاه آزاد اسالمی واحد دامغان و مسئول آزمایشگاه کشت بافت که ما را در انجام پژوهش فوق ياري نمودند كمال تشكر و قدرداني را می نمائیم.. 47
... بررسی اثر محرک های 1395 بهار - شماره بیست و دو مولکولی دوره ششم - تازه های بیوتکنولوژی سلولی Downloaded from ncmbjpiau.ir at 6:43 +0430 on Sunday July 22nd 2018 منابع. صفحه 423 1389 فصل نهم چاپ اول جلد چهارم چاپ اول انتشارات آستان قدس رضوی. تولید و فرآوری گیاهان دارویی. امیدبیگی ر 1. صفحه 438 1384 جلد دوم انتشارات آستان قدس رضوی. تولید و فرآوری گیاهان دارویی. امیدبیگی ر 2. صفحه 198 1384 معاونت پژوهشي دانشگاه علوم پزشكي تهران. متداول ترين گياهان دارويي سنتي ايران. امين غ ر 3 مرکز تحقیقات اخالق و انتشارات دانشگاه علوم پزشکی و خدمات بهداشتی درمانی تهران. متداول ترين گياهان دارويي سنتي ايران. امين غ ر 4. صفحه 300 1387 چاپ دوم تاریخ پزشکی و مقایسه متابولیت های شده در تولید کالوس با گیاه کامل Nepeta persica Bioss تولید و نگه داری کشت سلولی گیاه. پورشفیعی انارکی ف 5. صفحه 42 1379 دانشگاه علوم پزشکی اصفهان دانشکده داروسازی و علوم دارویی پایان نامه دکترای عمومی داروسازی بررسي اثر ساليسيليك اسيد بر ميزان برخي از متابوليت هاي ثانويه (ساپونين ها و آنتوسيانين ها) و القا مقاومت ضد. اسدی ا خاوری نژاد ر 6.586 553 )5( :21 1384. تحقیق ها گياهان دارويي و معطر ايران Bellis perennis L ميكروبي در گياه داروي مقایسه اثرات تسکینی و ضد اضطرابی عصاره "علف چای" با دیازپام در موش. جعفری ب احمدی زاده ج پاشازاده م درستکار ک رضایی ع 7.11 8 :)8(13 1389. مجله تحقیقات علوم پزشکی زاهدان. صحرایی. صفحه 532 1370 انتشارات دانشگاه تهران 5 جلد گیاهان دارویی. زرگری ع 8. انتشارات دانشگاه آزاد اسالمی شهرکرد 1389 ) گیاهان دارویی و معطر (شناخت و بررسی اثرات آن ها. قاسمی ع 9. اثر محلول پاشی اسید جاسمونیک بر درصد و ترکیبات اسانس آویشن دنایی. حامدی ب رحیم ملک م اشرافی م قاسمی پیربلوطی ع 10.80 75:2 1391 داروهاي گیاهی 11 Alali F, Tawaha K, Al Eleimat T. Determination of hypericin content in Hypericum triquetrifolium Tuna. (Hypericaceae) growing wild in Jordan. Natural Product Research. (2004). 18, 147 151. 12 Azizi M, Omidbeygi R. Effect of NP supply on herb yield, hypericin content and cadmium accumulation of St. John s wort ( Hypericum perforatum L.). Acta Horticulturae, (2002). 576: 267 271, ( full text in Persian ). 13 Bais HP, Walker TS, McGrew JJ, Vivanco JM. Factors affecting the growth of cell suspension cultures of Hypericum perforatum L. (St. John s Wort) and production of hypericin. In Vitro Growth & Development Plant. ( 2002). 38, 1 9. 14 Bari RJ, Jones, DG. Role of plant hormones in plant defense responses. Plant Molecular Biology. (2009). 69,473 488. 15 Barnes J, Anderson A, Phillipson D. St. John s wort (Hypericum perforatum L.): A review of its chemistry, pharmacology and clinical properties. Journal of pharmacy and pharmacology.(2001). 53, 583 600. 16 Bruni R, Sacchetti G. Factors affecting polyphenol biosynthesis in wild and field grown St. John s wort (Hypericum perforatum L. Hypericaceae/Guttiferae). Molecules. (2009). 14, 682 725. 17 Çirak C, Aksoy HM, Ayan AK, Saglam B, Kevseroglu KEnhanced hypericin production in Hypericum perforatum and Hypericum pruinatum in Response to Inoculation with Two Fungal Pathogens. Plant protection Science. (2005). 3, 109 114. 18 Conrath U, Pieterse CMJ, Mauch Mani B. Priming in plant pathogen interactions. Trends in Plant Science.(2002). 7, 210 216. 19 Denath M, Malik CP, Bisen PS. Micropropagation: a tool for the production of high quality plant based medicines. Current Pharmaceutical Biotechnology. (2006). 7, 33 49. 20 DeSmet P, Nolen WA. St. John s wort as an antidepressant. Br. J. Med. (1996). 313, 241 242. 21 Eganathan P, Parida A, Mahalakshmi R. Salicylic acid elicitation on production of srcondray metabolite by cell cultures of Jatropha curcas L. (2013). Vol 5, Suppl 4. 22 Epple P, Apel K, Bohlmann H. Overexpression of an endogenous thionin enhances resistance of Arabidopsis 48
Downloaded from ncmbjpiau.ir at 6:43 +0430 on Sunday July 22nd 2018 امیر رجبی و همکاران شماره بیست و دو مولکولی دوره ششم - تازه های بیوتکنولوژی سلولی against Fusarium oxysporum. Plant Cell. (1997). 9, 509 520. 23 Gadzovska S, MauryN S, Delaunay A, Spasenoski M, Joseph J, Hage`ge D. Jasmonic acid elicitation of Hypericum perforatum L. cell suspensions and effects on the production of phenylpropanoids and naphtodianthrones. Plant Cell Tissue Organ Culture. (2007). 89, 1 13. 24 Ganzera M, Zhao J, Khan IA. Hypericum perforatumchemical profiling and quantitative results of St. John s Wort products by an improved high performance liquid chromatography method. Journal of Pharmaceutical Sciences. (2002). 91, 623 630. 25 Ghasemi Pirbalouti A, Fatahi M, Craker L, Shirmardi H. Chemical and composition bioactivity of essential oils of Hypericum helianthemoides, Hypericum and perforatum Hypericum scabrum. Pharmaceutical Biology. (2013). DOI:10.3109/13880209.82163. ( full text in Persian). 26 Goyal SH, Ramawat. Ethrel treatment enhanced isoflavonoids accumulation in cell suspension cultures of Pueraria tuberosa, a woody legume. Acta Physiologiae Plantarum. (2008). 30(6), 849 853. 27 Leon J, & Sanchez Serrano J. J. Molecular biology of jasmonic acid biosynthesis in plants. Plant Physiology and biochemistry. (1999). 37, 373 380. 28 Kim HJ, Chen F, Wang X, Rajapakse NC. Effect of chitosan on the biological properties of sweet basil (Ocimum basilicum L.) Journal of Agricucture and Food Chemistry.(2005). 53, 3696 3701. 29 Kirakosyan A, Gibson DM, Kaufman PB. The production of dianthrones and philroglucinol derivatives in St. John s wort. In: Ramawat KG & Merillon JM (ed.) Bioactive Molecules and Medicinal Plants, pp: (2008). 151 164. 30 Koo A.J, Howe G.A. The wound hormone jasmonate. Phytochemistry. (2009). 70, 1571 1580. 31 Krzyzanowska J, Pecio L, Stochmal A, Oleszek W, Czubacka A, Przybys M, Doroszewska T. The effects of jasmonic acid and methyl jasmonate on rosmarinic acid production in Mentha 3 piperita cell suspension cultures, Plant Cell Tiss Organ Cult.(2011). DOI 10.1007/s11240 011 0014 8. 32 Kornfeld A, Kaufman PB, Lu CR, Gibson DM, Bolling SF, Warber SL, Chang SC, Kirakosyan A. The production of hypericins in two selected Hypericum perforatum shoot cultures is related to differences in black gland structure. Plant Physiology and Biochemistry. (2007). 45, 24 32. 33 Pretto RF, Santarem RE. Callus formation and plant regeneration from Hypericum perforatum leaves. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. (2000). 62(2), 107 113. 34 Raskin I. Role of salicylic acid in plants. Annu. Rev. Plant Physiol, Plant Mol. Biol. (1992). 43, 439 446. 35 Rossato L, Le Dantec C, Laine P, Ourry A. Nitrogen storage and remobilization in Brassica napus L. during the growth cycle: identification, and immunolocalization of a putative taproot storage glycoprotein. J. Exp. Bot.(2002). 53, 265 275. 36 Wang SY, Bowman L, Ding D. Methyl jasmonate enhances antioxidant activity and flavonoid content in blackberries (Rubus sp.) and promotes anti proliferation and promotes anti proliferation of human cancer cells. Food Chemistry. (2008). 107, 1261 1269. 37 Wurster M, Ali NA, Arnold N, Lindequist U, Wessjohan L. Essential Oil Composition from Oleogum Resin of Soqotraen Commiphora kua. Rec. Nat. Prod, 2(3), 70 75. 38 Zawoznik MS, Gropp MD, Tomaro ML, Benavides MPEndogenous salicylic acid potentiates cadmium induced oxidative stress in Arabidopsis thaliana. Plant Science. (2007). 173, 190 191. 39 Zobayed SMA, Afreen F, Kozai T. Temperature stress can alter the photosynthetic efficiency and secondary metabolite concentrations in St. John swort. Plant Physiol Biochem. (2005). 43,977 984. 49
50 Downloaded from ncmbjpiau.ir at 6:43 +0430 on Sunday July 22nd 2018